Fluorescensmikroskopi: principperne i metoden

Absorption og re-emission af lys yderligere uorganiske og organiske væsker er resultatet af phosphorescens eller fluorescens. Forskellen mellem fænomener er varigheden af intervallet mellem absorption og emission af lys flux. Når fluorescens af disse processer forekomme næsten samtidigt, mens morild - med en vis forsinkelse.

historiske oplysninger

I 1852, britisk videnskabsmand Stokes, beskrevne første fluorescens. Han indførte en ny periode som følge af forsøgene med flusspat, der udsender rødt lys under ultraviolet lys. Stokes bemærkede et interessant fænomen. Det konstateres, at bølgelængden af det fluorescerende stråling er altid større end strømmen af excitationslyset.

For at bekræfte hypotesen i det 19. århundrede har der været mange eksperimenter. De viste, at en række prøver fluorescerer under indflydelse af ultraviolet lys. Blandt de materialer, blandt andet været krystaller, harpikser, mineraler, klorofyl, rå lægemidler, uorganiske forbindelser, vitaminer, olier. Den direkte anvendelse af farvestoffer til biologiske forsøg begyndte kun i 1930,

Fluorescensmikroskopi: beskrivelse

Nogle af de, der anvendes i den første halvdel af studierne 20. århundrede materialer udstillet høj specificitet. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Takket være den ydeevne, som ikke kunne opnås ved kontrasterende metoder har metoden af fluorescensmikroskopi blevet et vigtigt værktøj inden for biomedicinsk og biologisk forskning. Lige så vigtige resultater blev opnået, og for materialer.

? Hvilke fordele gør metoden til fluorescensmikroskopi? Af nye materialer er blevet mulig og udvælgelsen af yderst specifikke celle submikroskopiske komponenter. Fluorescensmikroskopi kan detektere enkelte molekyler. En række farvestoffer tillader identifikation af flere elementer på en gang. Trods den begrænsede rumlige opløsning af diffraktionsgrænsen af udstyret, som til gengæld, afhænger af de specifikke egenskaber ved prøve, identifikation af molekyler under dette niveau er også meget muligt. Forskellige prøver efter bestråling udviser autofluorescens. Dette fænomen er meget udbredt i petrologi, botanik, halvlederindustrien.

Egenskaber

Undersøgelse animalsk væv eller patogener ofte komplicerede eller for svage eller meget stærke uspecifik autofluorescens. Værdien i undersøgelser erhverver indføring i de materielle komponenter ophidset ved en specifik bølgelængde og udsender den nødvendige lys flow intensitet. Fluorochromer fungere som farvestoffer er i stand til uafhængigt fastgjort til strukturer (synlige eller usynlige). har de således en høj selektivitet til målet, og kvanteudbyttet.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescensmikroskopi har været meget anvendt siden indførelsen af naturlige og syntetiske farvestoffer. De besad visse intensitet profiler af udsendelse og excitation og målrettet til specifikke biologiske mål.

Identificering af individuelle molekyler

Ofte under ideelle forhold, kan du registrere dig et separat element glød. Til dette blandt andet er det nødvendigt at tilvejebringe en tilstrækkelig lav støj af detektoren og den optiske baggrund. Fluorescein molekyle til at mislykkes på grund af fotoblegning kan afgive op til 300 tusind. Fotoner. Ved 20% samling processens effektivitet og kan registrere dem i en mængde på omkring 60 tusind.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescensmikroskopi baseret på avalanche fotodioder eller elektronisk multiplikation, tillod forskerne at observere opførslen af enkelte molekyler gennem den anden, og i nogle tilfælde endda minutter.

kompleksitet

Et centralt spørgsmål til fordel for undertrykkelse af optisk støj baggrund. På grund af det faktum, at mange af de, der anvendes i udformningen af filtre og linser udviser nogle autofluorescens materialer blev indsats af forskere i de tidlige stadier orienteret mod produktion af komponenter med et lavt fluorescens. Imidlertid har efterfølgende eksperimenter ført til nye konklusioner. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Navnlig blev det konstateret, at fluorescensmikroskopi baseret på total intern refleksion, det er muligt at opnå en lav baggrund og høj intensitet excitationslys.

mekanisme

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Principperne for fluorescens mikroskopi, baseret på total intern refleksion er brugen af kortvarig bølge eller flygtig. Den forekommer på grænsen mellem medier med forskellige brydningsindekser. I dette tilfælde lysstrålen passerer gennem prismet. Det har et højt brydningsindeks parameter.

Prismet støder op til den vandige opløsning eller glas med lav parameter. Hvis en lysstråle rettet mod det i en vinkel, der er mere kritisk, er strålen reflekteres totalt fra grænsefladen. Dette fænomen, igen forårsager nonpropagating bølger. Med andre ord, som det frembragte elektromagnetiske felt trænger ind i et medium med en lavere parameter til en afstand mindre end 200 nanometer brydningsindeks.

Den kortvarige bølge intensiteten af lyset ville være tilstrækkelig til at excitere fluorophorer. Men på grund af dens ekstremt lille dybde, vil dens volumen være meget lille. Resultatet er et lavt niveau baggrund.

modifikation

Fluorescens mikroskopi er baseret på total intern refleksion, kan implementeres med epi-belysning. Dette kræver linser med høj numerisk apertur (mindst 1,4, men det er ønskeligt, at den nåede 1,45-1,6), og delvist belyst felt apparat. Sidstnævnte opnås med en lille pletstørrelse. For større ensartethed ved anvendelse af en tynd ring, der er blokeret af en del af strømmen. For den kritiske vinkel, hvorefter der er en total refleksion, vi har brug for en høj grad af brydning af immersionsmediet i linsen og dækglasset af mikroskopet.