Molekylærgenetiske forskningsmetode

At undersøge og identificere varianter i DNA-struktur anvendes molekylærgenetiske metode. For hver DNA-området, der udforsker denne region af kromosomet, gen eller allel, metoderne er forskellige. Ligger bag hver molekylær genetisk fremgangsmåde omfatter nogle eller anden manipulation af RNA og DNA. Alle disse metoder er karakteriseret ved en enorme kompleksitet, uden laboratoriebetingelser ikke kan gennemføres, og personalet skal være højt kvalificerede. Dette arbejde udføres i flere etaper.

etaper

For det første at RNA- eller DNA-prøver skal fremstilles. Her kan en molekylærgenetisk metode anvendes på praktisk talt ethvert materiale: en dråbe blod, leukocytter, fibroblaster kultur, slimhinder (skrabet), selv hårsækkene, - DNA kan opnås fra en hvilken som helst prøve. Det er hensigtsmæssigt at bruge nogen molekylærgenetiske metoder og deres forskellige muligheder og har længe isoleret DNA opbevares frosset. Det andet trin er dedikeret til akkumuleringen af de ønskede fragmenter (amplifikationsprodukter) af DNA, da det hjælper med at sikre polymerasekædereaktion in vitro (in vitro uden inddragelse af levende organismer). Som følge heraf er de udvalgte DNA-fragment ganger af denne kædereaktion, og mængden af DNA-stiger bogstaveligt talt millioner af gange.

Det tredje trin i de molekylære genetiske forskningsmetoder antages multiplicerede DNA begrænsning (fragmentering, tåreflåd eller skæring). Begrænsning udført ved elektroforese på en polyacrylamid- eller agarosegel. Denne molekylærgenetiske metode til at studere DNA-fragmentet gør at alle kan tage en vis position i gelen. Derefter behandles gelen med ethidiumbromid, der er i stand til at binde til DNA, den bestråling med ultraviolet lys, så er det muligt at observere luminescens portioner. Molekylærgenetiske diagnostiske metoder er varierede og talrige, men de første to trin er fælles for alle. Men for at identificere DNA-fragmenter, kan gelen være farvet, og mange andre eksisterende metoder.

arter

Den mest direkte og udbredte metoder til påvisning af mycobakterier kan omfatte den ovennævnte molekylære genetiske DNA indlæringsmetode. Dens essens er, at for at identificere den scanning kæde materiale af specifikke DNA-fragmenter af patogener. Molekylærgenetiske diagnostiske teknikker endnu ikke har en mere effektiv måde at anerkende sådanne sygdomme som tuberkulose. Under anvendelse af polymerasekædereaktionen (PCR), kan man være sikker på, at den oprindelige DNA vil øge antallet af kopier i en million gange, det vil sige, der vil være amplifikation og det vil vise resultaterne. Følsomheden er meget højt - mere end femoghalvfems procent, hvilket er den største fordel ved denne fremgangsmåde.

Resten af molekylær-genetiske metoder til forskning om effektiviteten af udbyttet flere kopier bogstaveligt fordoblet, da der i dette tilfælde udarbejdelsen prøven viser en specifik oligonukleotidsekvens forøget til et hundrede og seks gange. Selv den kultur diagnose af tuberkulose i åndedrætsorganerne betydeligt sænker følsomheden. Dette er grunden til moderne medicin er baseret på molekylærgenetiske metoder til diagnosticering af tuberkulose. En beskrevne fremgangsmåde er effektiv, især når det drejer sig patogener af høj antigene variabilitet, fastlægge denne anden måde er langt vanskeligere - kræver særlige næringsmedier og dyrkning lang tid. Biokemiske og molekylærgenetiske fremgangsmåder frembringer meget forskellige indvirkning på resultaterne.

diagnose af tuberkulose

Marshall PCR diagnose af tuberkulose mest almindeligt at anvende disse DNA-sekvenser, der er specifikke for alle fire typer af sygdommen. At nå dette mål ofte anvende primere, der registrerer sekvens IS elementer (IS-986, IS-6110), da disse elementer karakterisere stærkt vandrende arter Mycobacterium tuberculosis og altid tilstedeværende flere kopier i genomet. Også DNA-ekstraktion kan udføres fra rene kulturer og Klinisk (sputum af patienter) efter enhver anden egnet fremgangsmåde. For eksempel er der Boom metode, hvor lysis buffer anvendes baseret på guanidinthiocyanat og silica som den bærer-DNA. Antallet af patienter, der adskiller sig dårlig bakteriologisk stiger hvert år, og derfor i klinisk praksis har etableret et helt andet niveau af organisation: molekylær-genetisk metode til at studere DNA har spillet en stor rolle i diagnosen.

Men vi må indrømme, at det ikke er uden ulemper. PCR metode er brugen af ofte bringer et stort antal falske positive resultater, og årsagen er ikke kun tekniske fejl, men også funktionerne i selve metoden. Under anvendelse af denne metode til diagnose at bestemme levedygtigheden af mycobakterier, der er blevet identificeret, er det simpelthen umuligt. Men denne ulempe er ikke det vigtigste. Molekylærgenetiske fremgangsmåder til PCR-diagnostik medføre risiko for forurening af mycobakterielt DNA. Certificering krav til denne grund, at for PCR laboratorier designet udelukkende hårdt, de kræver tre separate lokaler. PCR-teknologi er moderne og meget komplekst, det kræver brug af passende udstyr og højt uddannet personale.

bacterioscopy

Når diagnosen resultaterne af analysen skal sammenlignes med andre data: klinisk undersøgelse, røntgen, smøre mikroskopi, afgrøde og endda reaktion på en specifik behandling er meget vigtige. I denne serie, PCR undersøgelser er kun en af komponenterne. Detect patogenet i tidlig diagnose kan være den enkleste og hurtigste metoder - bakteriologiske.

Der anvendes et lysmikroskop (farvelægning Ziehl-Neelsen) og fluorescerende (farvestoffer fluorochromer). Fordelen er hastighed smøre resultaterne. Men dens ulempe er med rette betragtes som den begrænsede kapacitet på grund af lav følsomhed. Imidlertid er denne fremgangsmåde givet WHO henstilling som den mest økonomiske og jorden til at opdage tuberkulosepatienter. Påvisning af mycobakterier bakteriologisk metode har forudsigelse værdi og estimeret kvantitativt bakteriel udskillelse. Meget mere tillid til at beskæftige sig med det molekylærgenetiske forskningsmetoder på tuberkulose.

kulturer

Bedre påvisning af mykobakterier genkende kulturstudier. Udsæd patologisk materiale det er lavet i ægget medium: Mordovsky, Finn II, LJ og lignende. Referenceværdier for modstanden for mykobakterier til lægemidler og indirekte bevis for effektiviteten af en række mycobakterier og deres kolonier in vitro, hvis den anvendte forskning kultur. At øge andelen af isolation af mykobakterier podning af patologisk materiale holdes på flere miljøer.

At opfylde behovet for talrige kulturelle, patogen herunder tilskud og væsker. Bruges i dette system og automatiseret måling typen VANTES vækst. Afgrøder skal holdes i inkubation i op til syv til otte uger. På dette tidspunkt afgrøden med manglende vækst kan betragtes som negativ. Den mest effektive måde til at detektere Mycobacterium tuberculosis overveje biologiske prøver: diagnostisk materiale, inficerer marsvin, som er yderst modtagelige for TB.

Nogle tal

Interessant fagområde, som blev åbnet af PCR diagnostik var at undersøge M. tuberculosis - latent infektion. Det moderne begreb om TB-infektion tyder på, at ud af hundrede mennesker, der var i kontakt med M. tuberculosis, halvfems kan meget vel være inficeret, men kun ti af dem er aktiv sygdom er under udvikling. Andre har TB immunitet, og fordi halvfems procent af tilfældene infektionen forbliver latent. At bestemme et mønster det har hjulpet en molekylærgenetisk metode.

Genetikere siger, at femoghalvtreds procent af dem, hvis afgrøder patologisk materiale var negative, og firs procent af mennesker smittet med M. tuberculosis, men flyder med ingen radiografiske manifestationer af sygdom, modtog PCR positive svar. Det er en genetisk diagnostisk metode hjalp med at identificere patienter med risiko ved PCR undersøgelser med resultaterne af deres analyser (mikroskopi og kultur) blev negativ, og subklinisk infektion M. tuberculosis var til stede.

moderne forskning

Den Russiske Føderation og bakteriologiske laboratorier anvender en fremskyndet fremgangsmåde til absolutte koncentrationer: nitratreduktase aktivitet testet af Griess reagens mycobakterier. Anti-TB centre anvender en metode, der gør det muligt at bestemme lægemiddelresistens. Denne podning i flydende medier, hvor automatiseret radiometriske og fluorescerende regnskabssystem vækst af mykobakterier. En sådan analyse er gjort hurtigt - op til to uger.

I øjeblikket er nye metoder, der udvikles: lægemiddelresistens af mycobakterier måles ved genotypen niveau. Undersøgelse af de molekylære mekanismer i resistensgener og viser tilstedeværelse i mycobakterier. Disse gener er associeret med resistens over for visse lægemidler. For eksempel Kasa gener, inhA, katG resistent over for isoniazid, rpoB-genet - rifampicin 16SP RNA-gener og rpsL - streptomycin, EMB1 - til ethambutol, gyrA - et fluorquinolon og så videre.

mutationer

Den moderne diagnose forøgede signifikant molekylærgenetiske niveau fremgangsmåde til undersøgelse af DNA og fik lov til at udføre store studier af mutationer i hver deres spektrum. Nu ved vi, at de mest almindelige mutationer i 516, 526 og 531 codon rpoB-genet, og identificeret modstanden over for forskellige stoffer. Der er en hel række metoder til typning af mycobakterier ved anvendelse ikke blot de traditionelle metoder - biokemiske, biologiske og kulturelle, men også i vid udstrækning anvendes moderne molekylære genetiske teknikker. Der er allerede tilstrækkelige og giver den korrekte diagnose metode til påvisning af monogene sygdomme. De er baseret på DNA-undersøgelser i nøjagtige område af et bestemt gen. Dette er normalt en kompleks proces, tidskrævende og dyr, men de data, der er tilvejebragt ved molekylær genetisk analyse, er langt mere præcist og informativt end data fra alle andre analyser.

Det har længe været kendt, at DNA ikke ændrer for hele organismens liv, at det under alle celler med kerne odnakova, og det gør det muligt at tage en analyse af absolut alle celler i kroppen, på ethvert tidspunkt i ontogenese. Den beskadigede gen kan påvises før fremkomsten af de første symptomer til den kliniske fuldskala sygdom, såvel som hos raske heterozygote mennesker, men som har en mutation i genet. Molekylære genetiske arvelige sygdom diagnostiske metoder tillader at afsløre dens (direkte metode, DNA-diagnostik), samt at analysere segregering af sygdom i familie med markør-loci-DNA (genetiske polymorfier), som er tæt forbundet med en beskadiget gen (dvs. den indirekte tilgang af DNA-diagnostik). Direkte eller indirekte - eventuelle DNA diagnostik er baseret på fremgangsmåderne til identifikation af en nøje defineret del af det humane DNA.

direkte metoder

Direkte metoder til DNA-diagnose er, når den skyldige genet arvelig sygdom er kendt, som det er velkendt, og typer af dets mutationer. For eksempel en egnet direkte metoder i en række sygdomme. Denne Huntingtons chorea (extension CTG-gentagelser), phenylketonuri (R408W), cystisk fibrose (delF508, større mutationer) og lignende. Den væsentligste fordel ved den direkte metode er et helejet diagnostisk nøjagtighed, og der er ikke behov for at gøre et DNA-analyse af resten af familien. Hvis der findes en mutation i det tilsvarende gen, tillader det præcist godkende en diagnose af arvelighed, genotypebestemmelse for resten af belastet familie.

En anden fordel ved en direkte diagnosticering anses for at identificere en heterozygot bærer af dårlige mutationer fra pårørende og forældre, der døde af sygdommen. Dette gælder især for sygdomme autosomal recessiv. Ulemper ved direkte metoder også er tilgængelige. For at anvende dem, du har brug for at vide præcis lokalisere den unormale genet, exon-intron struktur af dens spektrum og dens mutationer. Ikke alle monogene sygdomme i dag har modtaget sådanne oplysninger. Informativt direkte metoder kan ikke betragtes som fuldstændig, fordi en og samme gen kan have et stort antal patologiske mutation, der forårsager udvikling af arvelige sygdomme.

indirekte metoder

Indirekte metoder i DNA-diagnostik anvendes på alle, i andre tilfælde, hvis den er beskadiget gen ikke er identificeret, men kun kromosomalt, eller hvis linjen diagnosen ikke gav resultat (det sker, hvis genet komplekse molekylære organisation eller en stor udstrækning, hvis der er en masse patologiske mutationer). Indirekte metoder udført adskillelse analyse af polymorfe markører i allel familie. Markører findes i det samme kromosomale region eller locus er tæt forbundet med sygdommen og repræsenterer deletioner eller insertioner, punkt substitutioner, gentagelser, og deres polymorfi skyldes forskellig mængde celler i blokken.

Mest praktisk for indirekte diagnose anses mikrosatellit og minisatellite polymorfismer, som er vidt udbredt i det humane genom. deres værdi udtrykt i højt informationsindhold, hvis beskadigelse af genetiske afstand mellem markøren og genet ikke er for stor. I sidstnævnte tilfælde er estimeringen nøjagtighed bestemmes i vid udstrækning frekvensen af rekombination mellem den polymorfe markør og skader. Indirekte diagnostiske fremgangsmåder tilvejebringer også obligatorisk indledende trin med allelfrekvenser af den analyserede population undersøgelse blandt patienter og bærere af mutationer, plus nødvendigheden af at bestemme sandsynligheden for rekombination af uligevægtsfænomener og vedhæftning markører og mutante alleler.

andre metoder

Korte segmenter af RNA eller DNA, såvel som enkelt gen visualiseret under mikroskopisk undersøgelse kan ikke være derfor at identificere mutationer, der er nødvendige ved molekylær genetisk diagnose. Der er en "Human Genome Project", samt andre fremskridt i molekylær genetik stærkt udvidet muligheden for diagnosticering af arvelige sygdomme - både præ- og postnatal. Disse fremgangsmåder kan give tidlig påvisning og lave en forudsigelse poly- og monogene sygdomme, hvis debut foregår i voksenalderen. Desværre, på grund af de tekniske muligheder i molekylærgenetiske undersøgelser er nogle gange ud over de etiske grænser, der er sat i forhold til arv, især når diagnosen er i ungdomsårene og barndom.

Strukturelle og numeriske kromosomafvigelser er de mest almindelige årsager til sygdom og kræft, og mange misdannelser. Kromosomafvigelser skal identificeres, hvilket er vigtigt for familierådgivning - at vurdere prognosen, sammen med reproduktiv risiko i fremtidige graviditeter. Kromosom analyse er "gold standard" af genetisk diagnose, men det er begrænset. Kun metoderne til molekylær genetisk analyse kan gøre mere, fordi der bruges kloning teknologi baseret fluorescerende mærker, der kan deres høje følsomhed til at identificere subtile kromosomale ændringer, der er umuligt at opdage klassiske cytogenetiske undersøgelser. Disse teknikker er i stigende grad at udvide vores diagnosticeringsmuligheder, når de undersøges, børn med udviklingsforstyrrelser, mental retardering, med mange andre arvelige sygdomme.

fund

Det er meget vigtigt for menneskeheden var genet struktur og funktion af viden, typer af variabilitet, evnen til at detektere arvelige sygdomme, der opstod i forbindelse med udviklingen af molekylær genetik. dens metoder er rettet mod undersøgelsen af DNA-molekylet - og når det er normal, og når den beskadiges. Fremstilling af desoxyribonucleinsyre sekvenser af nukleotider (DNA) strækker sig i stadier fra at modtage prøver til identifikation af individuelle fragmenter. Isolering af genomisk DNA fra cellerne, restriktion (rivning), amplifikation (kloning), elektroforese af fragmenterne (separering deres elektriske ladning og molekylvægt ved agarosegel). Identifikation af specifikke fragmenter lokaliseret på overfladen af et diskret stribe.

Derefter komme ind i act særlige filtre, hvorigennem passerer hvert fragment hybridisering med klonede DNA-fragmenter eller syntetiske radioaktive prober er en kontrol, som vil svare til hver testprøve. Hvis du ændrer positionen eller længde sammenlignet med proben, hvis et nyt fragment eller forsvundet - alt dette tyder på, at det analyserede gen har undergået omstrukturering i nukleotidsekvensen. Der er otte grundlæggende teknikker molekylærgenetiske studier: sekventeringsreaktioner (bestemmelse af DNA-sekvens), polymerasekædereaktion (stigning i antallet af sekvenser), fremstillingen af primere kendte gener, DNA-kloning, produktion af rekombinante molekyler afledt proteiner på grund rekombinante molekyler, skabelsen af et fuldstændigt sæt (indsamling bibliotek) klonede fragmenter, der blev opnået ved anvendelse af restriktion.